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Avant de commencer
Choisissez votre ou vos protéines cibles
Choisissez vos contrôles de charge. Nous recommandons GAPDH et/ou la vinculine, mais d’autres contrôles peuvent bien sûr être utilisés.
Choisissez une membrane de référence (PVDF ou nitrocellulose) pour la comparaison. Un essai en parallèle est le meilleur moyen d’évaluer les améliorations apportées à votre protocole.
Préparez une série de dilutions pour comparer la sensibilité des membranes (par ex. : 20, 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3 et 0,15 µg).
Réalisation du Western blot
Activez la membrane – sans méthanol
15 s EtOH → 2 min tampon de transfert → C’est parti !
Wet Transfer (30-90 V, 60-120 min)
Adaptez les conditions à la masse moléculaire de votre protéine cible.
Semi-dry transfer (0.4 A, 25 V, 20-30 min)
Utilisez les conditions recommandées pour un transfert optimal.
Si vous utilisez les conditions Turbo (< 10 min) avec le tampon Bio-Rad Trans-Blot Turbo, utilisez 0,8 A (constant), 20 V, 10 min.
Révélation et analyse
Utilisez votre protocole habituel
- Bloquez la membrane.
- Incubez avec vos anticorps primaire et secondaire.
- Procédez à la révélation
Comparez :
- Les bandes – présence et netteté
- L’intensité – signal obtenu
- Le bruit de fond – notamment à longue exposition
Stripping et reprobing – facultatif
VerdiBlot est compatible avec le stripping et le reprobing. Une optimisation selon vos anticorps et vos conditions expérimentales reste recommandée. Le protocole ci-dessous présente une procédure simplifiée.
Protocole simplifié
Commencez par des conditions douces. Immergez la membrane dans le tampon de stripping: 0,1 M glycine, pH 2,2 ; 0,1 % SDS ; 1 % Tween-20
Agitez pendant 10 à 20 min. Rincez ensuite la membrane 3 × 10 min avec du TBST / PBST.
Avant de poursuivre, ajoutez le substrat ECL et procédez à la révélation. Aucun signal ne doit être visible. Cela confirme que les anticorps utilisés lors de la première détection ont bien été éliminés. Si un signal persiste, répétez l’étape de stripping.
Bloquez ensuite à nouveau la membrane et procédez aux incubations avec le nouvel anticorps primaire puis l’anticorps secondaire, comme lors de la première détection. Pour plus de détails, consultez le guide complet.
Compatibilité de la membrane
Méthodes de détection
Entièrement compatible avec la détection par chimiluminescence et par fluorescence.
Compatible avec les anticorps monoclonaux et polyclonaux.
Agents de blocage
Compatible avec les agents de blocage couramment utilisés :
caséine, lait écrémé en poudre, BSA, bloqueurs synthétiques et solutions commerciales
(par ex. les tampons de blocage Azure).
Coloration des protéines totales
Ponceau S, Coomassie Brilliant Blue, colloidal gold, etc.
Voir d’autres résultats
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Questions fréquentes
FAQ FR
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